Molekularbiologie - Restriktionsenzyme

[pharma]

Das Restriktionsenzym EcoRI schneidet das Plasmid pUC19 (2686 bp) an Position 396, das Enzym BgII an Position 1813.
Nachdem 2 microgramm pUC 19-Plasmide für kurze Zeit mit den beiden Enzymen zusammen verdaut wurden,
erfolgte eine Auftrennung des Restriktionsansatzes durch Gelelektrophorese.
Durch Vergleich mit einem DNA-Standard (100 bp DNA Ladder) wurde die ungefähre Position der durch das Gel aufgetrennten Banden wie folgt ermittelt:
Jeweils eine Bande befindet sich bei:
1) ca. 3200 bp
2) ca. 2700 bp
3) ca. 2100 bp
4) ca. 1400 bp
5) ca. 1200 bp

a) Geben sie an, um was es sich bei den jeweiligen Banden handelt und erläutern Sie, warum sich die jeweiligen Banden an der jeweiligen Position befinden.
1)
2)
3)
4)
5)

b)Geben Sie jeweils die tatsächliche Länge der sich in den 5 Banden befindlichen DNA-Molekülen exakt an.

1)
2)
3)
4)
5)

Vielen Dank.
Beste Grüße

[Christopher Kreiss, Dipl.-Pharm.]

Hallo,


bei dem von Ihnen geschilderten Experiment könnte es sich um folgende Banden handeln:

1) ca. 3200 bp -> ungeschnittenes Plasmid pUC19 (langsamere Migration durch das Gel als geschnittenes Enzym, dadurch scheinbar mehr Basenpaare)

2) ca. 2700 bp -> Plasmid pUC19, einmal durch eines der beiden Enzyme geschnitten

3) ca. 2100 bp -> evtl. das Plasmid pUC19 in schneller durch das Gel wandernder 'supercoiled'-Form (wobei für diese eigentlich eine Bande bei etwa 1900 bp zu erwarten wäre, siehe http://res.hmu.edu.iq/Portals/0/User...leshooting.pdf, S. 450)

4) ca. 1400 bp -> Plasmid pUC19, von beiden Enzymen geschnitten (1813bp - 396 bp = 1417 bp)

5) ca. 1200 bp -> Zweites Fragment, das bei 4) entstanden ist (2686 - 1417 bp = 1269 bp)


Mit besten Grüßen -

C. Kreiss

[pharma]

Vielen Dank für Ihre Antwort.

Bei b) zu den tatsächlichen Banden von
1) ca. 3200 bp
3) ca. 2100 bp habe ich folgende Bande ausgerechnet:

1) (2686 bp -396 bp)+(2686 bp -1813 bp) = 3163 bp


3) 2686 bp -1813 bp +1269 bp = 2142 bp

Sind diese tatsächlichen Banden richtig?

Beste Grüße

[Christopher Kreiss, Dipl.-Pharm.]

Hallo,


bei den Banden 1) und 3) könnte es sich in der Tat auch um unterschiedliche Fragmente von pUC19 handeln, die sich wieder zusammengelagert haben. Ihre Rechnung erscheint mir in beiden Fällen plausibel.


Mit besten Grüßen -

C. Kreiss