Hplc

[alaun]

Hallo,

ich hätte zwei Fragen zur HPLC.

1) Warum gibt es am Anfang einen Lösungsmittelpeak? das Fließmittel fließt ja die ganze Zeit durch, sollte nicht detektierbar sein und wenn doch, müsste es ja ein kurzer Anstieg und dann ein ewiges Plateau ergeben.

2) Mir wurde erklärt, dass man einen hydrophilen Stoff an einer RP-Phase laufen lassen kann und dass dann das Fließmittel polarer sein muss als der Analyt, damit es nicht stärker mit der stationären Phase wechselwirkt als der Analyt. Das würde doch aber bedeuten, dass der Analyt viel lieber in der mobilen Phase bleibt als mit der stationären Phase wechselzuwirken. Könnte man also einen hydrophilen Stoff auch über eine Normalphase laufen lassen, indem man auch dort ein hydrophiles Fließmittel werwendet, dass lipophiler ist als der Analyt (und somit wieder weniger adsorbiert als der Analyt?). Mich verwirrt etwas diese kompromisslose Darstellung, dass es heißt "Normalphase -> lipophiles Fließmittel, RP-Phase -> hydrophiles Fließmittel". Kann man generell sagen, dass man lipophile bzw. hydrophile Moleküle an einer Normalphase bzw. RP-Phase trennt? Von meinem Verständnis her, müsste man beide Phasen in Abhängigkeit vom Fließmittel benutzen können.
Wenn ein hydrophiles Molekül an der Normalphase liegen bleibt und ich es dann an einer RP-Phase probiere, müsste ich dann nicht auch dort ein lipophileres LM nehmen, damit ich es nicht sofort eluiere? (Wo es doch heißt, bei RP-Phase wäre die mobile Phase lipophil....)

Ich hoffe, ich habe den Punkt meiner Verwirrung verständlich beschrieben

[Dr. Christoph Behrendt]

Hallo Alaun,

zu 1): vor allem ist die Druck- und Dichteschwankung, die im Moment des Durchflusses des Lösemittel durch den Detektor auftritt für den Lösemittelpeak verantwortlich zu machen. Aber auch Substanzen, die von der Säule "runtergespült" werden und vorweg laufen, können diesen charakteristischen Peak auslösen. Je stabiler die Druckverhältnisse sind und je homogener und sauberer (entgaster) das Lösungsmittel ist, desto kleiner fällt der Peak aus.

zu 2): Das Lösemittel konkurriert mit dem Analyten um Bindestellen an der unpolaren RP-Phase. Ist die mobile Phase unpolarer als der Analyt, dann wird der Analyt zugunsten der mobilen Phase von der stationären Phase verdrängt und es kommt zu keiner Auftrennung des Analysengemischs. Der Analyt würde in diesem Fall einfach vorneweg getragen werden und sie hätten keine oder so gut wie keine Trennböden mehr, die Auflösung der chromatographischen Trennung wäre entsprechend schlecht. Das Lösemittel darf natürlich auch nicht zu polar sein, damit sich der Analyt nicht, wie Sie richtig schreiben, in der mobilen Phase nur löst und kaum WW mit der stationären Phase eingeht. Der Analyt soll sich ja im besten Fall ständig von der mobilen in die stationäre Phase und vice versa verteilen und ein dynamisches Gleichgewicht eingestellt werden. Ist der Analyt basisch oder sauer, macht es Sinn eine gepufferte mobile Phase einzusetzen, die die Ausbildung der ungeladenen neutralen Form begünstigt.
Prinzipiell kann man sowohl an einer Normal- als auch an einer Umkehrphase trennen und die mobile Phase entsprechend anpassen. Wenn Sie ein polares Analysengemisch an der Normalphase auftrennen wollen, nehmen Sie aus demselben Grund wie oben beschrieben ein etwas unpolareres Lösemittel, das die unpolaren Anteile des Analysengemischs besser in die mobile Phase aufnimmt, so dass die polareren Anteile mehr in der stationären Phase verbleiben. Durch Steigerung der Polarität der mobilen Phase mithilfe eines Gradienten können Sie zu guter Letzt die polaren Bestandteile eluieren.
Umkehrphasen sind in der Praxis sehr viel beliebter als Normalphasen (abgesehen von DC-Trennungen), da sie wässrige Lösemittel als mobile Phasen einsetzen können (keine aufwendig getrockneten Lösemittel erforderlich) und viele Arzneistoffe eher eine mittlere Lipophilie aufweisen, so dass sie sich sehr schön an der Umkehrphase mithilfe eines Lösemittelgradienten mit vielen trennböden auftrennen lassen.

Viele Grüße

[alaun]

Umkehrphasen sind in der Praxis sehr viel beliebter als Normalphasen (abgesehen von DC-Trennungen), da sie wässrige Lösemittel als mobile Phasen einsetzen können (keine aufwendig getrockneten Lösemittel erforderlich) und viele Arzneistoffe eher eine mittlere Lipophilie aufweisen, so dass sie sich sehr schön an der Umkehrphase mithilfe eines Lösemittelgradienten mit vielen trennböden auftrennen lassen.

Das habe ich mich sogar auch schon gefragt, warum in der Praxis irgendwie immer RP genommen wird. Gut zu wissen!


Vielen Dank für Ihre ausführliche Erklärung